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新一代测序技术的发展和应用-田李
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资源简介

新一代测序技术的发展和应用-田李
DNA 测序技术在生命科学的发展中起着越来越
重要的作用。新一代测序技术是一种革命性的技术,
它的出现使得科研人员能够以相对较少的经费获得
以往望尘莫及的海量 DNA 序列,从根本上改变了人
们研究生命科学的方式 [1] 。现阶段,生命科学的研
究已经从以往研究单一基因转变为研究整个基因组,
其中既包括了基础研究中的基因组、转录组和表观
遗传,也涉及了应用研究中的医学诊断和农作物育
种等 [2] 。本文回顾了 DNA 测序技术的演化,并论
述了其在生命科学研究中的应用。
1 测序技术的发展
1.1 第一代测序技术
Sanger 等在 20 世纪 70 年代中期发明了 DNA 末
端终止法测序技术,他的发明第一次为人们开启了
解读生命遗传密码的大门,Sanger 本人也因此获得
了 1980 年诺贝尔化学奖 [3] 。DNA 末端终止法测序
技术的基本原理是 :通过在 DNA 聚合酶、模板、放
射性同位素标记的引物、dNTP 和 ddNTP 的作用下
发生延伸反应,由于 ddNTP 的存在,会形成长度不
一的 DNA 延伸片段 ;然后采用平板凝胶电泳,用 4
收稿日期 :2015-04-10
基金项目 :国家自然科学基金项目(31501588),中国博士后科学基金项目(2014T70621),山东省自然科学基金项目(ZR2013CQ018)
作者简介 :田李,博士,副教授,研究方向 :植物病原真菌的致病机理及比较基因组学 ;E-mail :tianlister@163.com
通讯作者 :赵云峰,博士,教授,研究方向 :细胞生物学 ;E-mail :yfz667788@163.com
新一代测序技术的发展和应用
田李 1  张颖 2  赵云峰 1
(1. 曲阜师范大学生命科学学院,曲阜 273165 ;2. 山东水利职业学院,日照 276826)
摘 要 : DNA 测序技术是人类探索生命秘密的重要研究手段。自第一代的 Sanger 测序技术诞生以来,DNA 测序技术经历了
三代变革,产生了第二代到第四代测序技术,统称为新一代测序技术。目前,新一代测序技术的数据产出能力呈指数增长,而且
这一技术本身也从依赖 DNA 聚合酶的生化反应转变为面向物理学中纳米技术的新领域。新一代测序对生命科学领域具有里程碑意
义,引领了科学研究模式革新和研究思维的转变。科研人员可利用新一代测序技术对基因组、转录组和表观组等诸多领域展深入
的研究。分析了新一代测序技术的特点,并对其未来的发展方向以及应用进行了展望。
关键词 : 新一代 DNA 测序 ;边合成边测序 ; 单分子测序 ;纳米孔 ;应用
DOI :10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.003
The Next Generation Sequencing Technology and Its Applications
Tian Li 1 Zhang Ying 2 Zhao Yunfeng 1
(1. College of Life Science,Qufu Normal University,Qufu 273165 ;2. Shandong Water Polytechnic,Rizhao 276826)
Abstract: DNA sequencing technology is an important research method in life science. Since the birth of the Sanger sequencing
technology, DNA sequencing technology has experienced three generations of change, resulting the second generation to the fourth generation
sequencing technology. DNA sequencing not only has been improving its productivity in an exponential growth rate but also been evolving
into a new technological territories toward physical disciplines of nanotechnology. Next generation sequencing that has landmark significance
of life sciences, can improve researches in the genome, transcriptome and epigenome. This review analyzes technical characteristics of the next
generation sequencers and provide prospective insights into their future development and applications.
Key words: next generation sequencing; sequence by synthesis ;single molecule sequencing ; nanopore ;applications
网络出版时间:2015-11-26 15:41:55
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2396.Q.20151126.1541.001.html
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11 2
条电泳道来分离 4 个反应的所得产物,便可以按顺
序读出相应的 DNA 序列。在那个年代,测序主要依
靠手工操作,难以自动化,并且依赖电泳技术,试
剂消耗也大,这些都极大限制了测序的通量。
其后在此技术原理的基础上产生了几次变革,
主要技术上的变化有以下三点 :(1)采用具有颜色
的荧光染料取代了放射性同位素标记 ;(2)采用毛
细管电泳技术取代了平板凝胶电泳技术 ;(3)并行
化程度更高。这其中应用最广泛的是 ABI 公司的
3730 测序仪,它可以在一次运行中分析 96 个样本,
读长最多可以超过 1 000 bp。这一代测序技术在人
类基因组计划的后期阶段起到了关键的作用,加速
了人类基因组计划的完成 [4] 。但是,由于其对电泳
分离技术的依赖,使其难以进一步提高分析的速度
和通过微型化降低测序成本,因此在 2005 年后,除
了在 PCR 产物测序和病毒的基因组测序中继续发挥
重要作用,其他均已较少采用。但由于其在原始数
据质量(准确率高达 99.999%)以及序列读长方面
具有的优势,它还将与新的测序平台并存。
1.2 第二代测序技术
高通量测序技术进入市场,使 DNA 测序技术
在 2005 年发生了重要转折,改变了测序的规模化进
程。Illumina、Roche 和 ABI 公司都推出了各自的新
一代 DNA 测序仪,主要技术革新有以下几点 :(1)
采用矩阵分析技术,实现了大规模并行化,使得矩
阵上的 DNA 样本可以被同时并行分析 ;(2)不再采
用电泳技术,使得 DNA 测序仪得以微型化,测序成
本大大降低 ;(3)边合成边测序,测序速度大幅提
高。与 Sanger 测序相比,第二代测序技术单次运行
产出序列数据量大,所以又被通称为高通量测序技
术。其技术原理是 :首先构建 DNA 模板文库,将
DNA 固定在芯片表面或微球表面 ;然后通过扩增形
成 DNA 簇或扩增微球 ;最后利用聚合酶或者连接酶
进行一系列循环的反应操作,通过 CCD 相机采集每
个循环反应中产生的光学事件信息,从而获得 DNA
片段的序列。
1.2.1 Illumina Genome Analyzer Illumina 公 司 于
2007 年以 6 亿美元收购基因测序公司 Solexa,推出
了成熟商业产品 Genome Analyzer [5] 。该技术利用单
链 DNA 两端的非对称接头将 DNA 片段固定在芯片
表面形成寡核苷酸桥,并将该芯片放置于流通池内,
完成 DNA 模板文库构建步骤。经过多个 PCR 循环
扩增出大量的复制产物,每一簇复制产物都分别固
定在芯片表面的特定位置上。然后,测序引物杂交
到扩增产物中的接头上,开始合成测序反应。在每
一轮的测序循环中,DNA 聚合酶和标记不同荧光基
团的 4 种核苷酸被同时加入到流通池中,按照碱基
互补配对的原则延伸一个核苷酸。此时采集荧光基
团所发出的荧光图像,就可以获得模板中这一位置
的 DNA 序列信息。为防止额外的延伸,每个核苷酸
的 3' 羟基是被封闭起来的,然后打开 3' 端,继续
进行下一轮反应并重复多次,以获得约 50 个碱基的
DNA 序列。
1.2.2 Roche 454 Genome Sequencer 该技术将固化
引物的微球与单链 DNA 相结合,构建 DNA 模板文
库 [6] 。调整微球与文库片段的比例,以保证大多数
微球只能结合 1 个单链 DNA 分子。油与水溶液混合
形成油包水结构乳滴,利用微乳滴 PCR 来生成扩增
产物。经过多轮循环,每个微球表面都结合了大量
相同的 DNA 片段。富集微球并转移到带有规则微
孔阵列的微孔板上,每个微孔只能容纳 1 个微球。
微孔板的其中一面可以进行测序反应,另一面则与
CCD 光学检测系统相接触。
新一代测序技术的发展和应用-田李

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